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水質(zhì)（糞）大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片

 分BD105Ⅰ和BD105Ⅱ兩個型號，請注意選擇型號。

1、適用范圍 水質(zhì)（糞）大腸菌群的測定紙片快速法

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了總大腸菌群、糞大腸菌群的快速測定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、生活污水、醫(yī)療機(jī)構(gòu)及禽畜養(yǎng)殖業(yè)等其他行業(yè)排放的廢水中（糞）大腸菌群的快速篩查。

本方法的檢出限為20MPN/L。

2、    2、規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容引用了下列文件或其中的條款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

3、     3、術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1總大腸菌群（total coliforms）

在37℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

3.2          糞大腸菌群（fecal coliforms）

44.5℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸氣的總大腸菌群，屬糞行來源，稱為糞大腸菌群。

4、方法原理

將一定量的乳糖、指示劑（溴甲酚紫和2，3, 5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及營養(yǎng)成分等吸附于一定面積的無菌濾紙上，當(dāng)細(xì)菌生長繁殖時，產(chǎn)酸使PH值降低，溴甲酚紫指示劑由紫色變黃色。同時，產(chǎn)氣過程相應(yīng)的脫氫酶在適宜的PH范圍內(nèi)，催化底物脫氫還原TTC形成紅色的不溶性三苯甲臜（TTF），即可在產(chǎn)酸后的黃色背景下顯示出紅色斑點(diǎn)（或紅暈）。通過上述指示劑的顏色變化就可對是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作出判斷，從而確定是否有（糞）大腸菌群存在，再通過查MPN表就可得出相應(yīng)（糞）大腸菌群的濃度值。

5、試劑和材料

除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑。

5.1市售水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群測試片：10ml水樣量紙片按附錄A的方法進(jìn)行質(zhì)量鑒定，達(dá)到要求后方可使用。

5.2無菌水

用新制備的去離子水或蒸餾水，按無菌操作要求，121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

5.3硫代硫酸鈉溶液：ρ(Na₂S₂O₃)=0.10g/ml

稱取硫代硫酸鈉10g，溶于適量蒸餾水（或去離子）中，稀釋至100ml，現(xiàn)配。

5.4乙二胺四乙酸二鈉（EDTA- Na₂）溶液：ρ(C₁₀H₁₄N₂O₈Na_2。 2H₂O)=0.15g/ml

稱取EDTA-Na₂ 15g,溶于適量蒸餾水（或去離子水）中，稀釋至100ml，此溶液保質(zhì)期為30d。

6         6、 儀器和設(shè)備

6.1     恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。

6.2     恒溫培養(yǎng)箱：44℃±0.5℃。

6.3     高壓蒸汽滅菌器：121℃、101.3kpa。

6.4     冰箱：0-4℃

6.5     移液管：1±0.01ml、10±0.1ml。

6.6     試管：φ15mm×150mm.

6.7     采樣瓶：500ml。

注1：移液器、試管、采樣瓶等玻璃器皿實(shí)驗(yàn)前要按無菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌20min，烘干，備用。

6          7、樣品

用滅菌器具，按照HJ/T 91的規(guī)定及無菌操作的要求，采集水樣400ml放入已滅菌的采樣瓶中。如果是經(jīng)加氯處理的廢水，需在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉（EDTA- Na₂）溶液（5.4）1.2ml，以消除干擾。酸性樣品，需調(diào)節(jié)胖胖的PH值至7.0-8.0。

采樣后2h內(nèi)檢測，否則，需10℃以下冷藏并6h內(nèi)送檢，實(shí)驗(yàn)室接樣后，應(yīng)將樣品放入0-4℃冰箱并2h內(nèi)測定。

注2:10mg硫代硫酸鈉可保證去除水樣中1.5mg余氯，硫代硫酸鈉用量克根據(jù)水樣實(shí)際余氯量調(diào)整。

7          8、分析步驟

8.1接種量

每個樣品按三個不同的接種量接種，每個接種量分別接種5張紙片，共接種15張紙片。

根據(jù)水樣的污染程度確定接種量，應(yīng)盡可能使5個接種量最大的紙片為陽性、5個接種量最小的紙片為陰性。

清潔水樣的參考接種量分別為10 ml、1 ml、0.1 ml，受污染水樣參考接種量根據(jù)污染程度可接種1 ml、0.1ml、0.01 ml或0.1 ml、0.01 ml、0.001 ml等，見下表1。

表1水樣接種量參考表

接種量小于1ml時，水樣應(yīng)制成稀釋樣品后使用。接種量為0.1ml、0.01 ml時，分別制成1:10稀釋樣品、1:100稀釋樣品。其它接種量的稀釋樣品依次類推。

1:10稀釋樣品的制作方法為：吸取1ml水樣，注入盛有9 ml無菌水的試管中，混勻，制成1:10稀釋樣品。其它稀釋度的稀釋樣品同法制作。

8.2接種、培養(yǎng)

水樣充分混勻，按無菌操作制作稀釋水樣及接種水樣。

清潔水樣，接種水樣總量為55.5ml，10 ml水樣量紙片5張，每張接種水樣10ml，1 ml水樣量紙片10張，其中5張各接種水樣1ml，另5張各接種1:10的稀釋水樣1ml。受污染水樣，接種3個不同稀釋度的1ml稀釋水樣各5張。

接種水樣應(yīng)均勻涂布于紙片上，紙片充分侵潤、吸收水樣，用手輕輕壓平，做好標(biāo)記。

測總大腸菌群時，在37±1℃的條件下培養(yǎng)18-24h后觀察結(jié)果；測糞大腸菌群時，在44.5±0.5℃的條件下培養(yǎng)18-24h后觀察結(jié)果。

注3：1、檢測糞大腸菌群時，紙片接種后應(yīng)立即放置于44.5±0.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在常溫下放置過久將影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

     2、紙片加入水樣后，短時間內(nèi)變黃或退色，表明水樣存在酸性物質(zhì)活氧化劑干擾，需按“7樣品”一節(jié)方法去除相應(yīng)干擾。

8.3結(jié)果判定

（1）紙片上出現(xiàn)紅斑或紅暈且周圍變黃，為陽性。

（2）紙片全片變黃，無紅斑或紅暈，為陽性。

（3）紙片部分變黃，無紅斑或紅暈，為陰性。

（4）紙片的紫色背景上出現(xiàn)紅斑或紅暈，而周圍不變黃，為陰性。

（5）紙片無變化，為陰性。

  結(jié)果判斷參照圖片見附錄B。

6          9、結(jié)果計(jì)算與表示

6.1     9.1結(jié)果計(jì)算

   根據(jù)不同接種量的陽性紙片數(shù)量，查MPN表（附錄C），經(jīng)下面的公司換算報(bào)告1L水中（糞）大腸菌群數(shù)：

6.2     9.2結(jié)果表示

   測定結(jié)果保留二位有效數(shù)字，大于100時以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示，結(jié)果的單位為MPN/L。平均值以幾何平均計(jì)算。

7         10、 精密度和準(zhǔn)確度

微生物檢測書記為偏態(tài)分布，按其統(tǒng)計(jì)分析要求，其檢測所得MPN值全部經(jīng)對數(shù)（以10為底）轉(zhuǎn)換后進(jìn)行以下分析。

10.1精密度

6家實(shí)驗(yàn)室分別對有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（15600MPN/L）、低濃度（4.0×10² MPN/L）、中濃度（1.0×10⁴ MPN/L）、高濃度（8.0×10⁴MPN/L）實(shí)際樣品的總大腸菌群進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為：4.5%～7.5%、3.5%～12.4%、4.5%～6.9%、2.8%～5.8%；實(shí)驗(yàn)室間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為：3.3%、12.6%、4.6%、1.6%；重復(fù)限為0.61、0.67、0.67、0.64；再現(xiàn)性限為1.09、0.81、0.66、0.69。

6家實(shí)驗(yàn)室分別對有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（12100MPN/L）、低濃度（1.0×10² MPN/L）、中濃度（4.0×10³ MPN/L）、高濃度（5.0×10⁴ MPN/L）實(shí)際樣品的糞大腸菌群進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為：4.5%～11.3%、11.4%～31.3%、2.8%～21.5%、3.9%～13.2%；實(shí)驗(yàn)室間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.2%、14.8%、11.9%、8.2%。重復(fù)性限為0.93、0.83、0.85、0.77；再現(xiàn)性限為1.28、1.44、1.35、0.89。

10.2           10.2準(zhǔn)確性

6家實(shí)驗(yàn)室對總大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（15600MPN/L）進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對誤差的范圍是-5.5%~-12.8%，相當(dāng)誤差的最終值為-8.8%±6.0%。

6家實(shí)驗(yàn)室對糞大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（12100MPN/L）進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對誤差的范圍是-3.8%~-16.0%，相對誤差的最終值為-10.3%±9.2%。

11              11、 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

11.1應(yīng)使用質(zhì)量鑒定合格的紙片。

11.2每批樣品應(yīng)用無菌水做全程序空白測定，培養(yǎng)后的紙片上不的有任何微生物生長，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。

11.3每批樣品應(yīng)使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽性、陰性對照試驗(yàn)�？偞竽c菌群測定的陽性菌株為大腸埃希氏菌，陰性菌株為金黃色葡萄菌；糞大腸菌群測定的陽性菌株為大腸埃希氏菌，陰性菌株為產(chǎn)氣腸桿菌。

上述標(biāo)準(zhǔn)菌株均制成濃度為300~3000個/ml的菌懸液，分別取相應(yīng)水量的菌懸液接種紙片，按“8.2接種、培養(yǎng)”一節(jié)的要求培養(yǎng)，大腸埃希氏菌應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。

12                 12、廢棄處理

使用后的器皿及廢棄物須用121℃高壓蒸汽滅菌20min后，器皿方可清洗，廢棄物作為普通垃圾處理。

微生物 快速檢測產(chǎn)品展示

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開展微生物測試片測試工作必備的常用實(shí)驗(yàn)室器材明細(xì)單

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