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GB/T 5009.199─2003
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類
農(nóng)藥殘留量快速檢測(cè)
Rapid
determination for organophosphate and
carbamate pesticide residues in vegetables
2003-08-11發(fā)布 2004-01-01實(shí)施
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了由酶抑制法測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速篩選測(cè)定。
速測(cè)卡法（紙片法）
2 原理
膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色），有機(jī)磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。
3 試劑
3.1 固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測(cè)卡）。
3.2 pH7.5緩沖溶液：分別取15.0g磷酸氫二鈉
[Na2HPO4·12H2O]與1.59g無水磷酸二氫鉀[KH2 PO4 ]，用500mL蒸餾水溶解。
4 儀器
4.1 常量天平
4.2 有條件時(shí)配備37℃±2℃恒溫裝置。
5 分析步驟
5.1 整體測(cè)定法
5.1.1
選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液，振搖50次，靜置2min以上。
5.1.2
取一片速測(cè)卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37℃恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。
5.1.3
將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。
5.1.4 每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照卡。
5.2 表面測(cè)定法（粗篩法）
5.2.1
擦去蔬菜表面泥土，滴2滴～3滴緩沖溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。
5.2.2 取一片速測(cè)卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。
5.2.3
放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37℃恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。
5.2.4
將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。
5.2.5 每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照卡。
6 結(jié)果判定
結(jié)果以酶被有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制（為陽性）、未抑制（為陰性）表示。
與空白對(duì)照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽性結(jié)果。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對(duì)照卡相同，為陰性結(jié)果。
對(duì)陽性結(jié)果的樣品，可用其它分析方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
7 附則
7.1 速測(cè)卡技術(shù)指標(biāo)
7.1.1 靈敏度指標(biāo)：速測(cè)卡對(duì)部分農(nóng)藥的檢出限見表1。
表1 部分農(nóng)藥的檢出限
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農(nóng)藥名稱 |
檢出限 / （ mg/kg ） |
農(nóng)藥名稱 |
檢出限 / （ mg/kg ） |
農(nóng)藥名稱 |
檢出限 / （ mg/kg ） |
|
甲胺磷 |
1.7 |
乙酰甲胺磷 |
3.5 |
久效磷 |
2.5 |
|
對(duì)硫磷 |
1.7 |
敵敵畏 |
0.3 |
甲萘威 |
2.5 |
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水胺硫磷 |
3.1 |
敵百蟲 |
0.3 |
好年冬 |
1.0 |
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馬拉硫磷 |
2.0 |
樂果 |
1.3 |
呋喃丹 |
0.5 |
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氧化樂果 |
2.3 |
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7.1.2
符合率：在檢出的30份以上陽性樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。
8 說明
8.1
蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測(cè)定法。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。
8.2
當(dāng)溫度條件低于37℃，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長，延長時(shí)間的確定，應(yīng)以空白對(duì)照卡用手指（體溫）捏3min時(shí)可以變藍(lán)，即可往下操作。注意樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照卡放置的時(shí)間一致才有可比性�？瞻讓�(duì)照卡不變色的原因：一是藥片表面緩沖溶液加的少、預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤，二是溫度太低。
8.3
紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)的時(shí)間以3min為準(zhǔn)，3min后的藍(lán)色會(huì)逐漸加深，24h后顏色會(huì)逐漸退去。
酶抑制率法（分光光度法）
9 原理
在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在412nm處測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化值，計(jì)算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。
10 試劑
10.1
pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。
10.2
顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4℃冰箱中保存。
10.3
底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆�。保存期不超過兩周。
10.4 乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3
min的吸光度變化 D A 0
值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫４嫫诓怀^四天。
10.5 可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的 D A
0 值應(yīng)控制在0.3以上。
11 儀器
11.1 分光光度計(jì)或相應(yīng)測(cè)定儀。
11.2 常量天平。
11.3 恒溫水浴或恒溫箱。
12 分析步驟
12.1
樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩1
min～2min，倒出提取液，靜置3 min ～5min，待用。
12.2
對(duì)照溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37℃放置15min以上（每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致）。加入0.lmL底物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3
min的吸光度變化值 D A 0 。
12.3
樣品溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值
D A t 。
13 結(jié)果的表述計(jì)算
13.1 結(jié)果計(jì)算
見式（1）。
抑制率(%)=[ ( D A 0 - D A t
)/ D A 0 ]×100…………………………（1）
式中： D A 0
——對(duì)照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；
D A t ——樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值。
13.2 結(jié)果判定
結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。
當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率≥50%時(shí)，表示蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2次以上。
對(duì)陽性結(jié)果的樣品，可用其它方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
14 附則
14.1 酶抑制率法技術(shù)指標(biāo)
14.1.1 靈敏度指標(biāo)：酶抑制率法對(duì)部分農(nóng)藥的檢出限見表2。
表2 酶抑制率法對(duì)部分農(nóng)藥的檢出限
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農(nóng)藥名稱 |
檢出限 / （ mg/kg ） |
農(nóng)藥名稱 |
檢出限 / （ mg/kg ） |
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敵敵畏 |
0.1 |
氧 化 樂果 |
0.8 |
|
對(duì)硫磷 |
1.0 |
甲基異柳磷 |
5.0 |
|
辛硫磷 |
0.3 |
滅多威 |
0.1 |
|
甲胺磷 |
2.0 |
丁硫克百威 |
0.05 |
|
馬拉硫磷 |
4.0 |
敵百蟲 |
0.2 |
|
樂果 |
3. 0 |
呋南丹 |
0.05 |
14.1.2
符合率：在檢出的抑制率≥50%的30份以上樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。
15 說明
15.1
蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。
15.2
當(dāng)溫度條件低于37℃，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長，延長時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對(duì)照測(cè)試3min的吸光度變化
D A 0
值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照溶液放置時(shí)間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對(duì)照溶液3min的吸光度變化
D A 0 值＜0.3 的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。
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